這張膜是 Transwell 實驗的核心，其孔徑大?。ㄍǔ?0.4 μm 至 12 μm）和是否包被基質(zhì)膠，決定了實驗的類型和目的。

• 物理隔離：
  上下室的細(xì)胞被膜物理性地隔開，互不接觸。
• 化學(xué)聯(lián)系：
  膜上的微孔允許培養(yǎng)基中的小分子物質(zhì)（如營養(yǎng)物質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子等）自由通過，從而實現(xiàn)上下室細(xì)胞之間的化學(xué)信號交流。

2.1 Transwell 共培養(yǎng)：無接觸的“對話”

原理：上室和下室的細(xì)胞通過半透膜進(jìn)行物質(zhì)交換，但不發(fā)生直接接觸。這使得研究者可以模擬體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞微環(huán)境，探究細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物等可溶性物質(zhì)對靶細(xì)胞的影響。

關(guān)鍵細(xì)節(jié)：

• 孔徑選擇：
  通常選擇 0.4 μm 或 1.0 μm 的小孔徑膜，確保細(xì)胞無法穿過，只允許可溶性物質(zhì)通過。
• 細(xì)胞接種：
  上室接種效應(yīng)細(xì)胞，下室接種靶細(xì)胞。注意控制細(xì)胞密度，避免過度生長。
• 培養(yǎng)時間：
  根據(jù)研究目的和細(xì)胞類型，培養(yǎng)時間從數(shù)小時到數(shù)天不等。

2.2 Transwell 遷移：細(xì)胞的“跨越”之旅

原理：細(xì)胞在趨化因子或血清的誘導(dǎo)下，主動穿過 Transwell 膜上的微孔，從上室遷移到下室。這個過程模擬了細(xì)胞在體內(nèi)從一個位置移動到另一個位置的能力，如腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞的歸巢等。

圖2：遷移實驗示意圖（細(xì)胞在趨化因子吸引下穿過微孔膜）

關(guān)鍵細(xì)節(jié)：

• 孔徑選擇：
  根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的孔徑。例如，腫瘤細(xì)胞常用 8 μm，白細(xì)胞常用 5 μm，內(nèi)皮細(xì)胞常用 3 μm。
• 無血清饑餓：
  上室接種前，細(xì)胞通常需要用無血清培養(yǎng)基饑餓處理 4-24 小時，以減少細(xì)胞隨機(jī)運動，增強(qiáng)對趨化因子的響應(yīng)。
• 趨化因子：
  下室加入含趨化因子（如 FBS、SDF-1、HGF 等）的培養(yǎng)基，上室加入無血清培養(yǎng)基。
• 孵育時間：
  根據(jù)細(xì)胞遷移速度，孵育時間從數(shù)小時到 24 小時不等。

2.3 Transwell 侵襲：穿透“屏障”的挑戰(zhàn)

原理：與遷移實驗類似，但侵襲實驗在上室膜上預(yù)先鋪設(shè)了一層基質(zhì)膠（如 Matrigel）。細(xì)胞需要分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠，然后才能穿過膜上的微孔，模擬細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的能力，這在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中尤為重要。

圖3：侵襲實驗示意圖（細(xì)胞需降解基質(zhì)膠屏障后才能穿膜）

關(guān)鍵細(xì)節(jié)：

• 基質(zhì)膠鋪設(shè)：
  這是侵襲實驗的關(guān)鍵步驟?；|(zhì)膠需在冰上稀釋，均勻鋪設(shè)在 Transwell 膜上，并在 37°C 孵育 30-60 分鐘使其凝固?；|(zhì)膠的濃度和鋪設(shè)厚度會影響實驗結(jié)果。
• 無血清饑餓：
  同遷移實驗，細(xì)胞需饑餓處理。
• 孔徑選擇：
  同遷移實驗，根據(jù)細(xì)胞類型選擇。
• 孵育時間：
  由于細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠，侵襲實驗的孵育時間通常比遷移實驗長，可能需要 24-72 小時。

三、 實驗操作：細(xì)節(jié)決定成敗

無論是哪種 Transwell 實驗，以下通用操作細(xì)節(jié)都至關(guān)重要。

3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

• 細(xì)胞狀態(tài)：
  確保細(xì)胞處于健康、對數(shù)生長期，活力良好。避免使用傳代次數(shù)過高的細(xì)胞。
• 細(xì)胞計數(shù)：
  準(zhǔn)確計數(shù)細(xì)胞，確保接種密度一致。細(xì)胞密度過高可能導(dǎo)致細(xì)胞堆積，影響穿膜。
• 饑餓處理：
  遷移和侵襲實驗前，務(wù)必進(jìn)行無血清饑餓處理，以消除血清中生長因子對細(xì)胞運動的非特異性刺激。

3.2 基質(zhì)膠鋪設(shè)（僅侵襲實驗）

• 冰上操作：
  Matrigel 在室溫下會迅速凝固，因此所有操作（稀釋、鋪設(shè)）都必須在冰上進(jìn)行，并使用預(yù)冷的槍頭和器皿。
• 均勻鋪設(shè)：
  將稀釋好的 Matrigel 均勻鋪設(shè)在 Transwell 膜的內(nèi)表面，避免氣泡。鋪設(shè)后立即放入 37°C 培養(yǎng)箱凝固。

3.3 細(xì)胞接種與誘導(dǎo)

• 上室接種：
  將處理好的細(xì)胞懸液（通常為無血清培養(yǎng)基）小心加入 Transwell 上室，避免產(chǎn)生氣泡或損傷膜。
• 下室誘導(dǎo)：
  下室加入含趨化因子或血清的培養(yǎng)基。注意下室培養(yǎng)基的量要足以浸沒 Transwell 膜的底部。

3.4 染色與計數(shù)